本期為您推薦浙江大學(xué)藥物生物技術(shù)研究所所長(zhǎng)李永泉教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表在Journal of Applied Microbiology上的一篇文章：Daptomycin production enhancement by ARTP mutagenesis and fermentation optimization in Streptomyces roseosporus。本研究利用ARTP進(jìn)行突變，采用耐藥性與顯色性雙報(bào)告系統(tǒng)成功篩選了一株高產(chǎn)達(dá)托霉素菌株。兩個(gè)報(bào)告基因的表達(dá)水平可以評(píng)價(jià)dptEp啟動(dòng)子的強(qiáng)度，dptEp啟動(dòng)子可以刺激達(dá)托霉素生物合成中dptE的表達(dá)水平，從而產(chǎn)生更多的達(dá)托霉素。本文首次在鏈霉菌中應(yīng)用雙報(bào)告系統(tǒng)和新的補(bǔ)料策略，為鏈霉菌次生代謝物的生物合成提供了新的途徑。
達(dá)托霉素(Daptomycin)是一種從玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces rosesporus)培養(yǎng)基中提取的新型環(huán)狀脂肽抗生素，由立派制藥公司于1997年成功開發(fā)。其商品名立普妥于2003年獲得美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)，用于治療復(fù)雜的皮膚感染。2006年，FDA進(jìn)一步批準(zhǔn)其用于治療革蘭氏陽性菌引起的心內(nèi)膜炎和菌血癥。
目前已有多種策略改造玫瑰孢鏈霉菌來達(dá)到高產(chǎn)達(dá)托霉素的效果，包括傳統(tǒng)誘變，核糖體工程和基因重組技術(shù)，由此得到的工程菌在搖瓶水平產(chǎn)量達(dá)到324 mg/L。盡管目前基因工程是提高菌株質(zhì)量的首選方法，但在許多情況下，隨機(jī)誘變?nèi)匀皇俏ㄒ豢尚械倪x擇。常壓室溫等離子體(ARTP)誘變是近年來發(fā)展起來的一種有效的誘變技術(shù)，具有成本低、操作簡(jiǎn)便、育種方法有效等優(yōu)點(diǎn)。利用APTR進(jìn)行誘變，同時(shí)使用報(bào)告基因?qū)φT變效率進(jìn)行篩選的方法尚未在玫瑰孢鏈霉菌中有過研究。
研究人員將野生菌株L2796中引入耐藥性與顯色性雙報(bào)告基因，對(duì)其進(jìn)行ARTP誘變。結(jié)果表明，當(dāng)處理時(shí)間為150 s時(shí)，致死率為80.20%，此時(shí)的陽性突變率為8.18%。對(duì)突變后的菌株進(jìn)行耐卡那霉素濃度檢測(cè)（圖2），野生菌株表現(xiàn)出對(duì)卡那霉素的高敏感性（<50 μg/mL），單輪突變菌株L2796-D對(duì)卡那霉素的耐藥性顯著提高（700 μg/mL）。在L2796-D基礎(chǔ)上進(jìn)行第二輪ARTP誘變，產(chǎn)生的L2796-D-M菌株卡那霉素耐藥性繼續(xù)升高（1200 μg/mL），該濃度下的野生菌株與L2796-D生長(zhǎng)被完全抑制（圖2a），同時(shí)串聯(lián)表達(dá)的顯色基因結(jié)果顯示L2796-D-M比單輪突變菌株L2796-D具有更深的顏色表征，表明在2輪突變后dptEp啟動(dòng)子強(qiáng)度顯著提升。
研究人員在40個(gè)菌株中發(fā)現(xiàn)其中的23個(gè)菌株中的GusA蛋白活性提高（圖3a），在這23株中有14株的達(dá)托霉素產(chǎn)量提高，最高產(chǎn)量達(dá)到95 mg/L（圖3b），比原生菌株提高了58.33%，將其命名為L2201。在傳代8代以后，其達(dá)托霉素產(chǎn)量沒有出現(xiàn)顯著降低，表明了遺傳的穩(wěn)定性（圖3c）。在搖瓶水平的基因的表達(dá)結(jié)果顯示，高產(chǎn)菌株L2201的兩個(gè)報(bào)告基因表達(dá)量相較于出發(fā)菌株均有一定的提升，報(bào)告基因的表現(xiàn)與達(dá)托霉素生物合成基因的表現(xiàn)是相互關(guān)聯(lián)的（圖4）。后期通過培養(yǎng)基配比與補(bǔ)料策略的優(yōu)化可以提升L2201的產(chǎn)量達(dá)到752.67 mg/L。該方法為研究高產(chǎn)達(dá)托霉素菌株的篩選提供新的途徑。
圖1 雙報(bào)告系統(tǒng)的建立及本文實(shí)驗(yàn)流程
圖2 突變株卡那霉素抗性試驗(yàn)及不同菌株 GusA活性分析
圖3 L2796-D-M的GusA活性，達(dá)托霉素產(chǎn)量和突變株L2201的遺傳穩(wěn)定性
圖4 搖瓶培養(yǎng)過程中dptE和Neo基因轉(zhuǎn)錄水平的變化
論文鏈接：
https://doi.org/10.1093/jambio/lxad230
本期為您推薦浙江大學(xué)藥物生物技術(shù)研究所所長(zhǎng)李永泉教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表在Journal of Applied Microbiology上的一篇文章：Daptomycin production enhancement by ARTP mutagenesis and fermentation optimization in Streptomyces roseosporus。本研究利用ARTP進(jìn)行突變，采用耐藥性與顯色性雙報(bào)告系統(tǒng)成功篩選了一株高產(chǎn)達(dá)托霉素菌株。兩個(gè)報(bào)告基因的表達(dá)水平可以評(píng)價(jià)dptEp啟動(dòng)子的強(qiáng)度，dptEp啟動(dòng)子可以刺激達(dá)托霉素生物合成中dptE的表達(dá)水平，從而產(chǎn)生更多的達(dá)托霉素。本文首次在鏈霉菌中應(yīng)用雙報(bào)告系統(tǒng)和新的補(bǔ)料策略，為鏈霉菌次生代謝物的生物合成提供了新的途徑。
達(dá)托霉素(Daptomycin)是一種從玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces rosesporus)培養(yǎng)基中提取的新型環(huán)狀脂肽抗生素，由立派制藥公司于1997年成功開發(fā)。其商品名立普妥于2003年獲得美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)，用于治療復(fù)雜的皮膚感染。2006年，FDA進(jìn)一步批準(zhǔn)其用于治療革蘭氏陽性菌引起的心內(nèi)膜炎和菌血癥。
目前已有多種策略改造玫瑰孢鏈霉菌來達(dá)到高產(chǎn)達(dá)托霉素的效果，包括傳統(tǒng)誘變，核糖體工程和基因重組技術(shù)，由此得到的工程菌在搖瓶水平產(chǎn)量達(dá)到324 mg/L。盡管目前基因工程是提高菌株質(zhì)量的首選方法，但在許多情況下，隨機(jī)誘變?nèi)匀皇俏ㄒ豢尚械倪x擇。常壓室溫等離子體(ARTP)誘變是近年來發(fā)展起來的一種有效的誘變技術(shù)，具有成本低、操作簡(jiǎn)便、育種方法有效等優(yōu)點(diǎn)。利用APTR進(jìn)行誘變，同時(shí)使用報(bào)告基因?qū)φT變效率進(jìn)行篩選的方法尚未在玫瑰孢鏈霉菌中有過研究。
研究人員將野生菌株L2796中引入耐藥性與顯色性雙報(bào)告基因，對(duì)其進(jìn)行ARTP誘變。結(jié)果表明，當(dāng)處理時(shí)間為150 s時(shí)，致死率為80.20%，此時(shí)的陽性突變率為8.18%。對(duì)突變后的菌株進(jìn)行耐卡那霉素濃度檢測(cè)（圖2），野生菌株表現(xiàn)出對(duì)卡那霉素的高敏感性（<50 μg/mL），單輪突變菌株L2796-D對(duì)卡那霉素的耐藥性顯著提高（700 μg/mL）。在L2796-D基礎(chǔ)上進(jìn)行第二輪ARTP誘變，產(chǎn)生的L2796-D-M菌株卡那霉素耐藥性繼續(xù)升高（1200 μg/mL），該濃度下的野生菌株與L2796-D生長(zhǎng)被完全抑制（圖2a），同時(shí)串聯(lián)表達(dá)的顯色基因結(jié)果顯示L2796-D-M比單輪突變菌株L2796-D具有更深的顏色表征，表明在2輪突變后dptEp啟動(dòng)子強(qiáng)度顯著提升。
研究人員在40個(gè)菌株中發(fā)現(xiàn)其中的23個(gè)菌株中的GusA蛋白活性提高（圖3a），在這23株中有14株的達(dá)托霉素產(chǎn)量提高，最高產(chǎn)量達(dá)到95 mg/L（圖3b），比原生菌株提高了58.33%，將其命名為L2201。在傳代8代以后，其達(dá)托霉素產(chǎn)量沒有出現(xiàn)顯著降低，表明了遺傳的穩(wěn)定性（圖3c）。在搖瓶水平的基因的表達(dá)結(jié)果顯示，高產(chǎn)菌株L2201的兩個(gè)報(bào)告基因表達(dá)量相較于出發(fā)菌株均有一定的提升，報(bào)告基因的表現(xiàn)與達(dá)托霉素生物合成基因的表現(xiàn)是相互關(guān)聯(lián)的（圖4）。后期通過培養(yǎng)基配比與補(bǔ)料策略的優(yōu)化可以提升L2201的產(chǎn)量達(dá)到752.67 mg/L。該方法為研究高產(chǎn)達(dá)托霉素菌株的篩選提供新的途徑。
圖1 雙報(bào)告系統(tǒng)的建立及本文實(shí)驗(yàn)流程
圖2 突變株卡那霉素抗性試驗(yàn)及不同菌株 GusA活性分析
圖3 L2796-D-M的GusA活性，達(dá)托霉素產(chǎn)量和突變株L2201的遺傳穩(wěn)定性
圖4 搖瓶培養(yǎng)過程中dptE和Neo基因轉(zhuǎn)錄水平的變化
論文鏈接：
https://doi.org/10.1093/jambio/lxad230
