本期為您推薦貴州大學(xué)生命科學(xué)院李祝教授課題組在基于微流控技術(shù)的高通量篩選方面相關(guān)的工作。該課題組通過(guò)液滴微流控平臺(tái)篩選拮抗菌，與傳統(tǒng)的瓊脂平板篩選方法相比，篩選效率提高了約3000倍。篩選得到的突變體，其抑菌活性較野生型菌株提高了62%。
圖1 拮抗菌的高通量篩選流程
軟腐病是一種嚴(yán)重影響農(nóng)作物的細(xì)菌性植物病害，主要由軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）引起，發(fā)生在蔬菜和觀賞植物的肉質(zhì)儲(chǔ)存組織中。這種病害可以迅速在植物體內(nèi)擴(kuò)散，造成組織水解、腐爛，最終導(dǎo)致作物減產(chǎn)甚至全軍覆沒，從而給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并成為限制農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。
隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，生物防治因具有生物防治效果好，無(wú)毒無(wú)害，無(wú)污染等特點(diǎn)越來(lái)越來(lái)受到人們的重視。農(nóng)用抗生素（生物活性物質(zhì)）、拮抗微生物等在病蟲害防治研究中得到了較好的應(yīng)用。傳統(tǒng)的拮抗菌篩選通常采用瓊脂平板法進(jìn)行的分離和篩選，具有高勞動(dòng)強(qiáng)度、高成本和低效率的限制因素，顯著影響拮抗菌的篩選和應(yīng)用。隨著液滴微流控技術(shù)的發(fā)展，利用其高通量的特性構(gòu)建新的篩選平臺(tái)—DREM Cell，顯著提高篩選效率的同時(shí)大幅降低了成本。
研究人員采集來(lái)自貴州省畢節(jié)市某魔芋種植區(qū)表面10 cm下的土壤樣本，分別采用液滴體系與培養(yǎng)皿體系進(jìn)行微生物資源探查。鏡檢結(jié)果顯示含菌液滴數(shù)量約占總液滴數(shù)量的12.22%，液滴中菌落數(shù)與平板數(shù)量基本一致，表明菌株在液滴中的生長(zhǎng)與平板培養(yǎng)具有相當(dāng)水平（圖2）。對(duì)不同培養(yǎng)條件下得到的菌落進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，液滴培養(yǎng)樣品中95%以上的OTU屬于稀有生物圈，其相對(duì)豐度在原始土壤樣品中低于0.01%（圖3），這表明液滴培養(yǎng)在揭示復(fù)雜微生物群落中罕見生物圈方面具有巨大潛力。
圖2 液滴生成和培養(yǎng)液滴樣品的顯微鏡圖像
圖3 不同培養(yǎng)樣品的擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果比較
利用GFP-Ecc15菌株作為報(bào)告菌，拮抗菌可以抑制報(bào)告菌株的生長(zhǎng)，從而顯著降低體系的熒光值（圖4，5）。在拮抗菌B. velezensis 和非拮抗菌E. coli 混合體系的富集篩選中驗(yàn)證了篩選體系的適用性，建立拮抗菌的高通量篩選模型。拮抗菌的最大富集效率達(dá)到226倍，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)拮抗菌的平均富集效率提高148倍。結(jié)果說(shuō)明，基于液滴微流控的篩選模型能夠很好地將對(duì)報(bào)告菌株具有抑制作用的細(xì)菌分離出來(lái)。
圖4 GFP-Ecc15在液滴中的生長(zhǎng)情況
圖5 拮抗菌與非拮抗菌對(duì)GFP-Ecc15熒光值的影響
最后基于該高通量模型，對(duì)土壤環(huán)境復(fù)雜樣本進(jìn)行拮抗菌株的篩選。以每小時(shí)105個(gè)細(xì)胞速率進(jìn)行分選，分選后的液滴涂布至平板，選取單菌落通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法驗(yàn)證其對(duì)病原指示菌Ecc15的抑菌能力。經(jīng)過(guò)篩選，32株具有抗菌活性的細(xì)菌被富集，其中最佳菌株的抑菌直徑達(dá)到20.86±1.56 mm。經(jīng)過(guò)ARTP誘變，抑菌直徑進(jìn)一步擴(kuò)大至26.15±0.29 mm，顯著大于出發(fā)菌株的18.31±0.64 mm（圖6），抑菌活性提升62%。
圖6 高活性突變體與野生型抑菌圈差異
本研究將液滴微流控技術(shù)與ARTP誘變結(jié)合，利用DREM Cell平臺(tái)開展高通量拮抗菌篩選工作，進(jìn)行環(huán)境微生物資源挖掘、復(fù)雜樣本拮抗菌株篩選以及菌株突變庫(kù)篩選工作。相較于傳統(tǒng)方法，培養(yǎng)基的試劑消耗降低至1.2×107分之一，篩選速率提升3000多倍，成功從土壤樣品中篩選并誘變得到高效的拮抗菌。該平臺(tái)為拮抗菌的篩選提供了一種更高效和成本更低的解決方案，為農(nóng)業(yè)生物防治提供了一個(gè)全新的視角，對(duì)于深入理解和利用隱藏于微小土壤顆粒中的生物資源有重要意義。
論文DOI：10.27047/d.cnki.ggudu.2023.001995
本期為您推薦貴州大學(xué)生命科學(xué)院李祝教授課題組在基于微流控技術(shù)的高通量篩選方面相關(guān)的工作。該課題組通過(guò)液滴微流控平臺(tái)篩選拮抗菌，與傳統(tǒng)的瓊脂平板篩選方法相比，篩選效率提高了約3000倍。篩選得到的突變體，其抑菌活性較野生型菌株提高了62%。
圖1 拮抗菌的高通量篩選流程
軟腐病是一種嚴(yán)重影響農(nóng)作物的細(xì)菌性植物病害，主要由軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）引起，發(fā)生在蔬菜和觀賞植物的肉質(zhì)儲(chǔ)存組織中。這種病害可以迅速在植物體內(nèi)擴(kuò)散，造成組織水解、腐爛，最終導(dǎo)致作物減產(chǎn)甚至全軍覆沒，從而給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并成為限制農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。
隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，生物防治因具有生物防治效果好，無(wú)毒無(wú)害，無(wú)污染等特點(diǎn)越來(lái)越來(lái)受到人們的重視。農(nóng)用抗生素（生物活性物質(zhì)）、拮抗微生物等在病蟲害防治研究中得到了較好的應(yīng)用。傳統(tǒng)的拮抗菌篩選通常采用瓊脂平板法進(jìn)行的分離和篩選，具有高勞動(dòng)強(qiáng)度、高成本和低效率的限制因素，顯著影響拮抗菌的篩選和應(yīng)用。隨著液滴微流控技術(shù)的發(fā)展，利用其高通量的特性構(gòu)建新的篩選平臺(tái)—DREM Cell，顯著提高篩選效率的同時(shí)大幅降低了成本。
研究人員采集來(lái)自貴州省畢節(jié)市某魔芋種植區(qū)表面10 cm下的土壤樣本，分別采用液滴體系與培養(yǎng)皿體系進(jìn)行微生物資源探查。鏡檢結(jié)果顯示含菌液滴數(shù)量約占總液滴數(shù)量的12.22%，液滴中菌落數(shù)與平板數(shù)量基本一致，表明菌株在液滴中的生長(zhǎng)與平板培養(yǎng)具有相當(dāng)水平（圖2）。對(duì)不同培養(yǎng)條件下得到的菌落進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，液滴培養(yǎng)樣品中95%以上的OTU屬于稀有生物圈，其相對(duì)豐度在原始土壤樣品中低于0.01%（圖3），這表明液滴培養(yǎng)在揭示復(fù)雜微生物群落中罕見生物圈方面具有巨大潛力。
圖2 液滴生成和培養(yǎng)液滴樣品的顯微鏡圖像
圖3 不同培養(yǎng)樣品的擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果比較
利用GFP-Ecc15菌株作為報(bào)告菌，拮抗菌可以抑制報(bào)告菌株的生長(zhǎng)，從而顯著降低體系的熒光值（圖4，5）。在拮抗菌B. velezensis 和非拮抗菌E. coli 混合體系的富集篩選中驗(yàn)證了篩選體系的適用性，建立拮抗菌的高通量篩選模型。拮抗菌的最大富集效率達(dá)到226倍，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)拮抗菌的平均富集效率提高148倍。結(jié)果說(shuō)明，基于液滴微流控的篩選模型能夠很好地將對(duì)報(bào)告菌株具有抑制作用的細(xì)菌分離出來(lái)。
圖4 GFP-Ecc15在液滴中的生長(zhǎng)情況
圖5 拮抗菌與非拮抗菌對(duì)GFP-Ecc15熒光值的影響
最后基于該高通量模型，對(duì)土壤環(huán)境復(fù)雜樣本進(jìn)行拮抗菌株的篩選。以每小時(shí)105個(gè)細(xì)胞速率進(jìn)行分選，分選后的液滴涂布至平板，選取單菌落通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法驗(yàn)證其對(duì)病原指示菌Ecc15的抑菌能力。經(jīng)過(guò)篩選，32株具有抗菌活性的細(xì)菌被富集，其中最佳菌株的抑菌直徑達(dá)到20.86±1.56 mm。經(jīng)過(guò)ARTP誘變，抑菌直徑進(jìn)一步擴(kuò)大至26.15±0.29 mm，顯著大于出發(fā)菌株的18.31±0.64 mm（圖6），抑菌活性提升62%。
圖6 高活性突變體與野生型抑菌圈差異
本研究將液滴微流控技術(shù)與ARTP誘變結(jié)合，利用DREM Cell平臺(tái)開展高通量拮抗菌篩選工作，進(jìn)行環(huán)境微生物資源挖掘、復(fù)雜樣本拮抗菌株篩選以及菌株突變庫(kù)篩選工作。相較于傳統(tǒng)方法，培養(yǎng)基的試劑消耗降低至1.2×107分之一，篩選速率提升3000多倍，成功從土壤樣品中篩選并誘變得到高效的拮抗菌。該平臺(tái)為拮抗菌的篩選提供了一種更高效和成本更低的解決方案，為農(nóng)業(yè)生物防治提供了一個(gè)全新的視角，對(duì)于深入理解和利用隱藏于微小土壤顆粒中的生物資源有重要意義。
論文DOI：10.27047/d.cnki.ggudu.2023.001995
