天木生物MMC成功助力高乙醇耐受性釀酒酵母的選育

? ? ? ?本期為您推薦河南科技學(xué)院楊天佑教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表在Journal?of The Science?of Food?and Agriculture上的一篇文章：Breeding of high-tolerance yeast by adaptive?evolution and high-gravity brewing of mutant。?本研究采用優(yōu)化的微生物微滴培養(yǎng)平臺(tái)(MMC)，對(duì)釀酒酵母進(jìn)行適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化(ALE)，篩選得到乙醇耐受性升高的菌株。對(duì)獲得的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行超高濃度釀造工藝研究，表明其在超高濃度啤酒釀造中具有應(yīng)用價(jià)值。

? ? ? ?啤酒是世界上消費(fèi)最廣泛的酒精飲料，近年來(lái)，越來(lái)越多的人喜歡飲用具有多種風(fēng)格和口味的精釀啤酒。烈性啤酒因?yàn)槠渚苹ê扛?、風(fēng)味濃郁、酒精含量高受到如中國(guó)，意大利和澳大利亞啤酒喜好者的追捧。烈性啤酒被定義為原始麥芽汁超過(guò)16°P(柏拉圖度)和酒精含量超過(guò)6.5%(v/v)的啤酒。但是超高濃度的釀造會(huì)使得釀酒酵母發(fā)酵緩慢和活力低下，其中乙醇脅迫源是影響釀造的最主要因素，因此選育高乙醇耐受性菌株成為超高濃度釀造的主要途徑。

? ? ? ?目前提高釀酒酵母酒精耐受性的主要方法包括適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化(ALE)、誘變、原生質(zhì)體融合，以及基因操作如基因組編輯、代謝工程和靶向基因表達(dá)調(diào)控等技術(shù)。ALE是利用生物體適應(yīng)所選擇的環(huán)境條件的能力來(lái)改良菌株，而傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法操作繁瑣、產(chǎn)量低、效率低、耗費(fèi)大量的人力和試劑，導(dǎo)致ALE耗時(shí)耗力。而近期基于液滴微流控技術(shù)的新型微生物培養(yǎng)和篩選系統(tǒng)，即自動(dòng)高通量微生物微滴培養(yǎng)系統(tǒng)(MMC)，可以有效的解決上述傳統(tǒng)培養(yǎng)所出現(xiàn)的問(wèn)題，為高效率的篩選乙醇耐受性酵母提供技術(shù)基礎(chǔ)。

? ? ? ?研究團(tuán)隊(duì)首先利用前期篩選得到的菌株YN81，在不同濃度的乙醇條件下進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)12%的乙醇存在時(shí)，酵母生長(zhǎng)停滯，因此選取6%-12%作為適應(yīng)性進(jìn)化濃度范圍。在MMC中生成50個(gè)液滴體系，在50天的馴化時(shí)間內(nèi)分別6%，6.6%，7.2%，?7.8%，?8.4%，9.0%，9.6%?和12%梯度添加乙醇，傳代時(shí)間設(shè)定為11 h。最后在12%濃度的乙醇條件下，有3株菌可以良好的生長(zhǎng)，分別為1，3，45號(hào)液滴（圖1）。在300、340、380和420 g/L蔗糖的YPD培養(yǎng)基下，篩選菌株的生長(zhǎng)速度均高于親本菌株YN81，其中YN81mc-8.3在420 g/L蔗糖濃度下的細(xì)胞濃度明顯高于其他菌株，顯示出較好的糖耐受性（圖2）。同時(shí)在不同濃度的乙醇脅迫下YN81mc-8.3也顯示出最好的乙醇耐受性（圖3）。

? ? ? ?對(duì)獲得的優(yōu)良菌株在遺傳穩(wěn)定性，超高濃度釀造以及啤酒的口感風(fēng)味方面進(jìn)行分析（圖4-7）。結(jié)果顯示篩選出的菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，在釀造過(guò)程中的麥汁速率以及最終的乙醇含量均高于野生型。對(duì)釀造出的啤酒進(jìn)行感官分析表明YN81mc-8.3生產(chǎn)的烈性啤酒在視覺(jué)、嗅覺(jué)和味覺(jué)特征方面有著更好的表現(xiàn)。這些結(jié)果顯示MMC在高濃度乙醇耐受性的釀酒酵母選育方面具有應(yīng)用前景。